,هورمونی,الایزا,کیت,آزمایشگاه,فاسکو
    گروه فعلی : ایمونولوژی
 
پرسش : 
روش کار الایزا
روش کار الايزا ( الیزا ) چگونه است؟
 
پاسخ به این پرسش
پاسخ های ارسالی برای این پرسش
الايزا ۱۳۸۹ چهارشنبه ۱۲ خرداد

الان اين تكنيك گسترش زيادي يافته است و متدهاي ان بسط و گسترش يافته اند منتهي پايه تستهاي الايزا مبني بر اصول BIolabling مي باشد اين روش در حقيقت يك روش اسپكترو فتومتري در اندازه كم مي باشد و اصول ان بر اساس واكنش بين آنتي ژن و آنتي بادي مي باشد. به شما توصييه مي كنم كه مقالات و منابع زيادي در مورد اين روش مطالعه فرمائيد.

marand

تشکر 3 +

4+ 4 0+
روش كار ۱۳۸۹ يکشنبه ۱۶ خرداد

ست الايزا را در حالت معمول براي رديابي آنتي ژن يا آنتي بادي بكار مي برند بدين ترتيب كه يكي از اين دو ماده در بستر جامد ثابت مي شود و براي رديابي دومي بكار گرفته مي شود، اما اساسا براي رديابي هر جفت ماده اي كه مثل جفت آنتي ژن و آنتي بادي به هم گرايش داشته و قدرت اتصال مناسبي نسبت به هم دارند ميتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتين به ليگاند مربوطه اش يا مولكول به گيرنده اختصاصي اش) البته اين پديده يعني اتصال بين دو ماده اي كه آنتي بادي و آنتي ژن نيستند اما گرايش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرين است و براي بالا بردن حساسيت و اختصاصيت اتصال بين آنتي بادي و آنتي ژن در الايزا بايد اين اتصالات ناخواسته را به طريقي مهار كرده و يا كارهاي جبراني لازم را در نظر گرفت. 1 ) تست اليزا برای جستجوی آنتي ژن: ELISA روش بسيار حساسي است که (معمولا) برای جستجوی آنتي ژن يا آنتي بادی بکار ميرود در تحت شرايط تنظيم شده (از نظر غلظت يوني و pH) پروتئين ها (آنتي ژن يا آنتي بادي) به طور خودبخود تمايل دارند که به بستر جامد (در اين تست plate هايی از جنس پلي استيرن) متصل شوند، ماهيت اين اتصال بخوبي معلوم نشده است اما برگشت پذير بوده و با استفاده از pH هاي بالاتر يا پايين تر و استفاده از غلظت هاي يوني بالا اتصال قطع ميشود اين نوع اتصال خودبخودي اگر چه ظرفيت محدودی دارد ولي با بكارگيري سيستم های تقويتي مناسبي مثل سيستم آنزيم-سوبسترا اين اتصالات وسيله بسيار خوبي برای طراحي سيستم الايزا گرديده است. براي انجام الايزا: 1 ) ابتدا بايد پروتئين مورد نظر را به كف پليت چسباند. 2 ) نقاط اتصال باقي مانده را بايد با محلول پروتئيني مناسب مسدود كرد. 3 ) محلول مورد آزمايش را اضافه كرد تا دو ماده همديگر را پيدا كرده و متصل شوند 4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه را براي افزايش حساسيت آزمايش بكار گرفت 5 ) سيستم آنزيمي نهايي را به راه انداخته و رنگ نهايي توليد شده را اندازه گرفت حال اين 5 مرحله به تفكيك توضيح داده مي شوند: 1 ) اتصال پروتئين به كف پليت (Coating): آنتي ژن (يا آنتي بادی) در مقاديری در حدود ميکروگرم به داخل چاهک پليت الايزا اضافه شده و فرصت داده ميشود تا به مقدار کافي به کف چاهك (well) متصل شود براي اينكار بسته به نوع پروتئين بافرهاي مختلفي به كار گرفته مي شود و غلظت پروتئين نيز بايد مناسب سازي شود در مقادير بسيار پايين حساسيت رديابي پايين مي آيد و در مقادير بالاي آنتي ژن اتصالات سستي نيز برقرار ميشود كه در مراحل بعدي كنده شده و هنگام شستشو آنتي ژن همراه با آنتي بادي اختصاصي دفع مي شوند و لذا حساسيت تست مجددا پايين مي آيد. بطور كلي اين مرحله اساسي بوده و نقش زيادي در نتيجه نهايي دارد ايده آل هاي مورد انتظار براي اين مرحله اينها هستند: الف) مقدار آنتي ژن متصل شده به كف همه چاهك هاي يك پليت بايد يكنواخت باشند و كمترين واريانس را در نتيجه ايجاد كنند، بدين معني كه وقتي يك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمايش كنيم بايد نتايج بدست آمده به هم نزديك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنين اگر آزمايش مورد نظر در حجم بالا انجام ميگيرد و چند پليت را هم زمان كوت نموده و استفاده ميكنيم بايد جنس پليت ها و شركت تهيه كننده آنها يكسان باشد تا از خطاي مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پليت ها جلوگيري شود و ترجيحا بافر كوتينگ و زمان كوتينگ و محلول آنتي ژني آماده شده براي كوتينگ بهتر است يكسان باشند. ب) اتصالات برقرار شده بين آنتي ژن و بستر جامد بايد به اندازه كافي محكم و قوي باشند تا در مراحل شستشوي بعدي كنده نشوند، معمولا براي آنتي ژن هاي عادي، اتصال دهنده اضافي لازم نيست ولي اگر آنتي ژني استثنائاً با روش معمول به كف پليت نچسبيد يا اتصالات سستي برقرار كرد از مواد و روش هاي خاصي براي اتصال آنتي ژن به كف بستر استفاده مي شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئيد يا اشعه ايكس يا ...). ج) پروتئين متصل شده نبايد آنقدر كم باشد كه نتواند مقادير بالاي آنتي بادي را جذب كند در اين صورت غلظت هاي بالاي آنتي بادي قابل تشخيص نخواهد بود از طرفي پروتئين متصل شده نبايد آنقدر زياد باشد كه اتصالات غيراختصاصي از اتصالات اختصاصي بيشتر شوند كه در اين صورت جواب آزمايش قابل اغتماد نخواهد بود براي تامين اين سه هدف تمهيدات خاصي به كار گرفته مي شوند كه در فرصتي مناسب توضيح داده خواهند شد 2 ) مرحله مسدود سازي يا بلوكينگ (blocking): نقاطي از كف پليت كه با پروتئين اختصاصي پوشانده نشده اند با استفاده از محلول هاي پروتئيني خنثي (از اين نظر كه در واكنش اختصاصي بعدي اثر سوئي ندارد) پوشانده مي شوند محلول هاي پروتئيني براي اين منظور حاوي شير کم چربي يا آلبومين گاوی يا ژلاتين و يا کازئين ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت هاي غير يوني خاصي نظير Tween 20 يا Tween 80 يا ... نيز به عنوان كمكي استفاده مي شوند نوع اين مواد و مقادير بكار برده شده به صورت تجربي تعيين مي شوند و با توجه به تجربيات ديگران مي توان محدوده خاصي را براي كار مورد نظر امتحان كرد و بهترين غلظت را بدست آورد (چون پروتئين ها از ريشه هاي جانبي متفاوتي برخوردارند لذا براي پروتئين هاي بسيار خالص مثل پروتئين هاي ريكامبينانت مناسب سازي اين تركيبات در بالا بردن اعتبار نتايج بسيار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يوني بافر بلوك كننده نيز اهميت زيادي دارد و براي اتصال انتخابي پروتئين مورد نظر (از ميان مخلوط پروتئيني) ميتوان بافرهاي مختلف و غلظت يوني متفاوت را ارزيابي كرده و بهترين بافر را براي آزمايش مورد نظر بدست آورد. 3 ) اتصال آنتي ژن و آنتي بادي محلول مورد آزمايش كه احتمال ميرود حاوي مقادير قابل رديابي از آنتي بادي بر عليه آنتي ژن اختصاصي موجود در كف پليت ميباشد در اين مرحله در بافر مناسبي تهيه شده و اضافه مي شود آنتي بادي شناور در محلول، آنتي ژن متصل به بستر را پيدا كرده و به آن متصل مي شود بندرت اين آنتي بادي متصل به آنزيم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزيمدار در مرحله بعدي بكار گرفته مي شود. آنتي بادي هاي متصل نشده با عمل شستشو از محيط حذف مي شوند بافر شستشو معمولا داراي پروتئين خنثي به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. چرا؟ حاوي دترژانت ميباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافري مناسب براي اتصال آنتي ژن با آنتي بادي است. آنتي بادي ها، سرم ، و محلولهاي بكار گرفته شده در مراحل مختلف الايزا معمولا در بافر شستشو رقيق مي شوند. 4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه سيستم تقويتي اوليه قبل از سيستم تقويتي اصلي (كه همانا بكار گرفتن خصوصيت آنزيمهاست) ميباشد در اين مرحله ما واكنش هاي اضافه تري را به كار ميگيريم تا قدرت اندازه گيري تست (حساسيت و اختصاصيت) بالا برده شود. بدين منظور از قدرت تقويت كنندگي بيوتين-آويدين، بيوتين-استرپتاويدين، لكتين-ليگاند و ... استفاده مي شود. 5 ) تقويت آنزيمي هر آنزيمي بر روي سوبستراي اختصاصي خود اثر كرده و آنرا به محصول تبديل مي كند اين واكنش در طي زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهي از محصول در محيط مي شود بدين معني كه با گذشت زمان معيني يك مولكول آنزيم مي تواند مولكول هاي سوبستراي بسياري را به محصول تبديل كند اين اثر افزايشي در حقيقت اساس الايزا را تشكيل ميدهد. بدين ترتيب كه آنتي بادي نهايي باقي مانده پس از شستشوي نهايي با مولكول آنزيم متصل است و افزودن سوبسترا در طي زمان معيني (مثلاً يك ساعت) منجر به آزاد سازي مقادير متنابهي سوبسترا مي گردد كه يا خود رنگي ميباشد يا در واكنش با ماده ديگري (كروموژن يا رنگزا) كه به محيط اضافه شده است رنگ توليد ميكند در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصي خوانده شده و محاسبات لازم بر روي داده هاي بدست آمده انجام مي گيرد اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گيری سيتوکين در روش الايزاي ساندويچي مولكول اندازه گيري شده در واقع در بين دو مولكول مختلف آنتي بادي قرار ميگيرد (ساندويچ ميشود) مثلا اين روش را در مورد اندازه گيري سايتوكاين اينترفرون گاما شرح ميدهيم: اساس) سلول های طحالي گرفته شده از موش های دريافت کننده واکسن در اثر تحريک با آنتي ژن اختصاصي در محيط کشت تکثير پيدا خواهند کرد برای تعيين اينکه غالب سلول های تکثير يابنده از نوع Th1 هستند يا Th2 بايد پروفيل سيتوکيني در محيط کشت مشخص شود بدين منظور تعيين مقدار سيتوکين های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محيط کشت مد نظر قرار ميگيرد. چنانكه در شكل زير مشخص شده است در اين روش آنتي بادی منوکلونال ضد آنتي ژن به کف plate چسبانده ميشود سپس فرصت داده ميشود تا آنتي ژن (در اين تحقيق سيتوکين IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتي بادی پلي کلونال ضد آنتي ژن اضافه ميشود که متصل به آنزيم پراكسيداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ايجاد محصول رنگي ميشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت ميگردد چون در اين روش آنتي ژن در بين دو آنتي بادی قرار ميگيرد لذا به ساندويچ مشهور شده است.

marand

تشکر 3 +

4+ 4 0+
دستگاه الایزا و کیت الایزا ۱۳۸۹ سه شنبه ۱۱ خرداد

خیلی بهتر می شود که در مورد هر دو، هم دستگاه الایزا و هم روش کار کیت الایزا راهنمایی بفرمائید.ممنونم.

spiderman

تشکر 1 +

2+ 2 0+
روش کار الایزا ۱۳۸۹ سه شنبه ۱۱ خرداد

لطفا سئوالتان را کامل بفرمایید آیا منظور شما نحوه کار دستگاه الیزا است یا روش الیزا؟

dafy

تشکر 1 +

2+ 2 0+
نام کاربری :
نام رمز :
 

دستگاه اتو آنالايزر الايزا و كمولومينسنس|ThunderBolt full automated ELISA & CLIA Proccessor System بازار بزگ خدمات و ملزومات آزمایشگاهی و پزشکی
هیئت علمی سایت فاسکو
   اعضاء هیئت علمی سایت
این صفحه را به دوستان خود معرفی کنید
ایمیل :

جستجوی دوستان و کاربران در فاسکو
نام
 
راهنمای رقابت برترین های فاسکو
جدول رده بندی برترین کاربران جدید
:: نحوه امتیاز گیری در رقابت علمی فاسکو
:: شرایط پذیرش مقالات  
محصولات فاسکو
:: كاتالوگ دستگاه اتوآنالایزر كمي لومينسنس و الایزا Thunderbolt
:: مشخصات  کیت های  BIOKIT
:: مشخصات  کیت های CALBIOTECH
:: مشخصات  کیت های VIRO-IMMUN
چاپ فرم های آزمایشگاهی فاسکو
:: فرم هدایت الکتریکی آب مقطر
:: فرم ثبت دمای انکوباتور
:: فرم ثبت دمای یخچال
برترين كاربران دهمین دوره رقابت فاسكو 
: rashidi[امتیاز 0]
: Nosrati1386[امتیاز 0]
: Abbas_Nakhjavani[امتیاز 0]
4 : chello[امتیاز 0]
5 : nasri[امتیاز 0]

لیست کامل برترین های فاسکو
  
کلیه حقوق معنوی و مادی این سایت برای شرکت تحقیقاتی تولیدی فارمد آوران سبز محفوظ است 2017®

کلومیفن, ویتامین, میکروگرم, کیت های ایده آل, نکروز, هپاتیت, تیروئیدیت, مارک, تخمدان, سرطان‌زا , دکترای علوم آزمایشگاهی, سلولها و موکوس, ویتامین دی, میکروارگانیسمها, ازمایشگاه پاتوبیولوژی دانش, ‏Post-PCR‏, آندرولوژی, فضایی, آبله, پروتکل 4 دارویی توسط FDA , جيوه, ویتامین, پارازيتولوژيكي, مرانشيمال, فلایشمان, آکادمی, استريم, ماکروسیتیک, ترومبوز, پستانک, سرم كنترل‌هاي بين المللي بايورد, نامحلولند, استریل‌ترین, گالاکتوز, ویروسها, هموگلوبین, بیلیروبینوری, پیروات،, اليمنتاسيون, آدنو, چرب, نفلومتری و توربیدو متری, period, استرکوبیلین, آپاتیت, عملکرد انسولین, گلبولین, اختلال در چربی های خون, وفور, آنتی بادی موجود در کف چاهک ها, میکروارگانیسم, هاگ, توزيع كننده كيت, عفونت‌زا, واکسن, Hemosiderin, هماتوکریت, شته‌ها, پکتین, Oligonucleotide, نانوالیاف, انمی همولیتیک, زندگي با همه مسائل و سختي هايش خيلي زيباست., نانوبلورالماس, نيتريت, نانوباکتریال, تسکین درد کمر, کارسینوم, سلولهاي کبدي, هیدروژنی,