,هورمونی,الایزا,کیت,آزمایشگاه,فاسکو
 
 
6 نظرات  ELISA
  تاریخ : ۱۳۸۹ پنج شنبه ۸ مهر  [8:52]  

ELISA

ELISA اختصارات چیست؟ :  این واژه مختصر شده Enzyme Linked Immunosorbent Assay است.

الایزا چیست؟ :  الایزا یکی از چند ده متدی است که جهت تشخیص و اندازه گیری دسته ای از بیومولکولها به کار می رود و ابداع ان از انجا ناشی شده است که سایر متد ها به دلایل مختلف شامل 1-قادر نبودن 2-حساسیت پایین 3- دقت پایین 4- پر زحمت بودن 5- غیر قابل اتوماسیون بودن 6-گران بودن روش کنار گزارده شده اند.

اساس متد الایزا چیست؟ :  اساس متد الایزا بر پایه انتی بادی استوار است در این متد با استفاده از خواص منحصر به فرد انتی بادی شامل قدرت اتصال بالای ان به انتی ژن ( Affinity) و شناسایی دقیق و صحیح انتی ژن (ُSpecificity) بهره گرفته می شود تا بیومولکولهای مورد جستجو شناسایی و اندازه گرفته شوند.در این متد جهت ایجاد سیگنال از انزیم ها و سوبستراهایی که تولید رنگ نمایند استفاده می شود . سپس رنگ ایجاد شده توسط دستگاه مربوطه جذب ان قرائت می گردد.

طبقه بندی در الایزا چگونه است؟ :  متد الایزا به سه روش کلی تقسیم بندی می گردد که هریک برای منظور خاصی طراحی می گردد این طبقه بندی بدین صورت است 1-ساندویچ الایزا : از این نوع الایزا عمدتا برای تشخیص و اندازه گیری بیومولکولهای پروتیینی استفاده می گردد بیومولکولهایی مانند  TSH-LH_FSH-Ferr 

2-الایزای غیرمستقیم : از این نوع الایزا عمدتا جهت تشخیص و اندازه گیری میزان انتی بادی ضد عوامل عفونی در مایعات بیولوژیک استفاده می گردد بنابر این در این روش از الایزا ما بدنبال انتی بادی ها هستیم انتی بادی هایی نظیر IgA-IgG-IgM 

3- الایزای رقابتی : بیومولکولهایی که به دو روش فوق قابل شناسایی و سنجش نمی باشند به کمک الایزای رقابتی شناسایی و اندازه گیری می شوند هاپتن ها و مولکولهای پروتیینی بسیار کوچک از این چمله به شمار می روند بیومولکولهایی نظیر تیروکسین-تری یدوتایرونین-استرادیول-کورتیزول 

اجزا الایزا :  در متد الایزا عناصری در کنار یکدیگر قرار می گیرند که واکنش این عناصر با یکدیگر در نهایت منجر به تشخیص و اندازه گیری بیومولکول مورد نظر می گردد در ادامه به معرفی این عناصر خواهیم پرداخت.

- میکروپلیت های الایزا : میکروپلیت های الایزا عمدتا شامل 96 میکروول( microwell) می باشند که می تواند در جنس-رنگ-و خواص فیزیکو شیمیایی تنوع زیادی داشته باشند برای مثال جنس این میکروپلیت ها می تواند پلی استایرین -پلی پروپیلن باشند  رنگ پلیتها نیز بسته به متد الایزا میتواند شفاف-سیاه-ویا سفید باشد. از خواص فیزیکوشیمیایی این میکروپلیتها می توان به ظرفیت اتصال انها اشاره کرد تقسیم بندی در این مبحث عمدتا به سه دسته پلیتهای با ظرفیت اتصال پایین-پلیتهای با ظرفیت اتصال متوسط-و پلیت های با ظرفیت اتصال بالا تقسیم بندی می گردند از دیگر خواص فیزیکوشیمیایی میکروپلیت های می توان به شکل ظاهری این میکروول ها اشاره کرد که می توانند ته صاف(flat buttom)-ته گرد( round buttom) - و v شکل(V-shaped) باشند. چنین پلیتهایی به پلیتهای خام ( uncoated) معروف هستند.میکروپلیتها در متد الایزا درواقع نقش یک فاز یا محیط جداکننده را بازی می کنند.در متد الایزا بسته به متد بکار رفته بیومولکهای خاصی را در سطح داخلی این میکروول های کوت(coating) می کنند این بیومولکولها می توانند شامل انتی ژنها- انتی بادی ها -هاپتنهای متصل به پروتیین -رسپتورها-و پروتیین ها باشند. کوتینگ این بیومولکولها به سطوح داخلی میکروولهای به دو صورت عمده انجام می شود که شامل کوتینگ به کمک اتصالات غیرکووالانسی و کوتینگ به کمک اتصالات کووالانسی.از مزیتهای کوتینگ به کمک اتصالات کووالانسی می توان به پایین بودن مصرف بیومولکول کوت شونده - عدم تغییر ساختار فضایی بیومولکول کوت شونده-جهت یابی فضایی درست بیومولکولها - محکم بودن اتصالات به پلیت و بالتبع پایداری بسیار بالای میکروپلیت های کوت شده اشاره کرد.  

استانداردها :  در الایزا معمولا از چندین استاندارد استفاده می شود و این از انجا ناشی می شود که رفتار برهم کنش شیمیایی انتی بادی انتی ژن اگر چه وابسته به غلظت است همانند دیگر واکنش های شیمیایی اما دقیقا همانند یک واکنش شیمیایی ساده از یک معادله خطی تبعیت نمی کند که بتوان با داشتن دو استاندارد به معادله ان دست یافت در واقع رفتار برهم کنش اجزا الایزا در یک معادله درجه 2 و بالاتر مطابقت می کند.درچنین حالتی هرچه تعداد نقاط بیشتر باشد شکل درست تری از محنی استاندارد خواهیم داشت.در الایزا از عمدتا 6 استاندارد استفاده می گردد تا بتوان مقادیر پایین - نرمال - و بالا را مورد سنجش قرار داد .ماتریکسی که در ان استاندارد ساخته می شود می بایست تا حد امکان به سرم انسان شبیه باشد در بعضی موارد که ساخت ماتریکس استاندارد به دلایل مختلف ازجمله عدم امکان حذف انالیت مورد جستجودر سرم-وجود مداخله گرهای شناخته شده و شناخته نشده- پرزحمت و پر هزینه بودن  استانداردها در ماتریکس های مصنوعی ساخته می شوند و ازانجایی که به ماتریکس سرم انسانی شباهت کامل ندارد می تواند بر میزان یکنواختی-حلالیت-فعالیت انتیژنیک-ساختار کامل فضایی بیومولکول مورد مطالعه اثر بگذارد که می بایست در انتخاب یک ماتریکس مناسب برای استاندارد ها این موارد مد نظر باشد.معمولا جهت ساخت استاندارد از بیومولکولهای بسیار خالص ان که بصورت تجاری در دسترس هستند استفاده می گردد .اگرچه برای بعضی از بیومولکولها استانداردهای بین المللی وجود دارد اما به راحتی دردسترس نیستند-به میزان کافی دردسترس نیستند-به میزان بسیار محدود تولید می شوند و در مورد بعضی بیومولکولها استاندارد بین المللی وجود ندارد.  

کنژوگه :   کنژوگه ها در متد الایزا می تواند به اشکال عمده کنژوگه هاپتن به انزیم و کنژوگه انتی بادی به انزیم و یا کنژوگه اویدین به انزیم باشد.انزیمی که در متد الایزا پرکاربرد شده است HRP(Horse Radish Peroxidase  است اما از انزیمهای دیگری مانند الکالین فسفاتاز هم استفاده می شود.از انجا که در کنژوگه ها از انزیم استفاده شده است و انزیم ها بیومولکولهای ناپایداری محسوب می گردند چه ازنظر ساختاری و چه ازنظر فعالیت انزیماتیک بنابر این در برابر عوامل تاثیرگذار حساس هستند عواملی مانند دما-الودگی -و مهارکننده ها.بنابراین پایدار نگه داشتن کنژوگه ها مقوله مهم در بحث کنژوگه ها می باشد.کنژوگه ها را معمولا در محلولهای پایدار کننده که دارای مواد نگه دارنده نیز هستند تهیه می کنند میزان پایداری کنژوگه ها به نوع این محلولهای پایدارکننده و به غلظت این محلولها و به غلظت کنژوگه در این محلولها بستگی دارد البته دمای نگه داری محلولی که کنژوگه در ان تهیه شده است را نباید فراموش کرد.از انجایی که هرچه غلظت کنژوگه در محلول پایدار کننده بیشتر باشد پایداری ان نیز بشتر است بیشتر شرکت های سازنده سعی بر این دارند که کنژوگه ها را بصورت غلیظ 10Xو یا 20X عرضه کنند.

سوبسترا و کروموژن :  در الایزا چنانچه از انزیم HRP استفاده گردد از پراکسید هیدروژن به عنوان سوبسترا استفاده می گردد که در برابر نور حساس است و به راحتی به طور خودبخود تجزیه می گردد بهمین خاطر ان را در ویالهای تیره نگه داری می کنندو ازانجایی که به محض در اختیار قرار گرفتن برای انزیم به سرعت تجزیه می گردد به عنوان سوبسترای B یعنی سوبسترای دوم تعیین می شود تا میزان رنگ تولید شده متناسب با فعالیت انزیمی باشد.سوبسترای A درواقع ماده رنگزا محسوب می شود این ماده رنگزا برای HRP می تواند TMB-ABTS-و یا OPD باشد .و اگر انزیم در الایزا الکالین فسفاتاز باشد سوبسترای ان p-NPP پارا نیتروفنیل فسفات است که در حضور انزیم فسفات خود را ازدست می دهد و ماده باقی مانده یعنی پارا نیتروفنول که زرد رنگ است به عنوان میزان فعالیت انزیم مورد استفاده قرار میگیرد.درمورد متد الایزا که از انزیم HRP در ان استفاده شده است جداسازی سوبسترا ها به صورت A و B اگرچه میزان پایداری خیلی بالایی را به دست می دهد اما سوبستراهای یک مرحله ای نیز بصورت تجاری موجود هستند که پایداری قابل مقایسه ای دارند. بعضی از این سوبستراهای یک مرحله ای دارای مزیت های افزون تری نیز هستند شامل افزایش شدت رنگ ایجاد شده در مقایسه با سوبستراهای معمولی که منجر به افزایش حساسیت کیت خواهد شد و دیگر اینکه این سوبسترا ها رنگی نیز می باشند که باعث می شود کاربر دچار اشتباه نگردد و یا در دستگاههای اتومات الایزا بتوان برای میزان این ریاجنت سیستم هشدار دهنده طراحی کرد.

محلول متوقف کننده :  بسته به اینکه جهت بررسی میزان فعالیت انزیم از چه متدی استفاده شود محلول متوقف کننده ممکن است مورد نیاز باشد یا نباشد.به عبارتی دیگر اگر شیوه بررسی فعالیت انزیم کینتیک است به محلول متوقف کننده نیازی نیست و اگر end point است باید استفاده گردد. محلولهای اسیدی مانند HCl و H2SO4 برای توقف فعالیت انزیم HRP و محلول NaOH برای توقف فعالیت انزیم ALP مورد استفاده قرار می گیرد.


sampler

 

از انجایی که سمپلر ها از مهمترین ابزارها وعمده ترین منبع رخ دادن خطاها در کار با کیت های الایزا می باشد لازم می باشد تا قدری در رابطه با این ابزار و نحوه کار با ان اشنا شویم تا حد امکان بروز خطا در کار با این ابزار به حداقل برسد.

برای پی بردن به اهمیت یادگیری نحوه صحیح کار با سمپلر لازم می دانم یک محاسبه ریاضی را دراینجا بیاورم .برای مثال یک سمپلر ثابت 50 میکرولیتر را در نظر بگیرید چنانچه شما در حین سمپلینگ به میزان 5 میکرولیتر خطا داشته باشید در واقع دچار 10% ایجاد خطا با سمپلر گشته اید(50/5 =10%) و همینطور اگر به اندازه 2.5 میکرولیتر خطا داشته باشید در حین کار با سمپلر در واقع دچار 5 % ایجاد خطا گشته اید( 50/2.5= 5%) . به عنوان مثالی دیگر یک سمپلر 10 میکرولیتر را در نظر بگیرید چنانچه شما اگر به اندازه 2 میکرولیتر خطا داشته باشید در واقع به اندازه 20 %دچار خطا گشته اید و حتی اگر به اندازه 1 میکرولیتر خطا داشته باشید در واقع به اندازه 10 % دچار خطا گشته اید . این دو مثال به وضوح اهمیت نحوه صحیح کار با سمپلر را نشان می دهد و همینطور می رساند که کالیبره بودن سمپلر ها و اگاه بودن از کالیبره بودن ان تا چه حد می تواند حیاتی و مهم باشد. 

در کار با سمپلر نکات بسیار زیادی نهفته است که رعایت انها می تواند کاربر را تا حدود بسیار زیادی از صحت و درستی کارش مطمئن سازد.گذشته از دانستن نحوه کار با سمپلر برند سازنده سمپلر - و داشتن تجربه در کار با سمپلر مقدمتا مواردی هستند که می بایست مورد توجه قرار گیرند.

شیوه هایی مختلفی که در کار با سمپلر می توان از ان بهره برد شامل موارد ذیل می باشد.

1) step1 - step1  :   در این شیوه در step1 محلول توسط سمپلر کشیده می شود و در همان step1  محلول تخلیه می شود

2) step1 - step2  :   در این شیوه در step1  محلول توسط سمپلر کشیده می شود و لی در step2  محلول تخلیه می شود.

3) step2 - step1  :  در این شیوه در step2  محلول توسط سمپلر کشیده می شود ولی در step1  محلول تخلیه می گردد.

توصیه می شود از روش 2 در مواردی استفاده شود که حجم نمونه ها کمتر از 10 میکرولیتر است چرا که در این حجم به علت مقدار کم نمونه و از طرفی ویسکوزیته یا چسبندگی نمونه ها سبب می شود که مقداری از نمونه در سمپلر ها باقی بماند.

از روش 3 در مواردی بهتر است استفاده شود که نیاز به سرعت عمل است و یا مواردی که در سرسمپلر حباب در حین کار تشکلیل می شود.

روش 1 پر استفاده ترین روش نحوه استفاده از سمپلر است اما در مواردی که احتمال تشکیل حباب در سرسمپلر می رود و از طرفی نیاز است که سمپلینگ با سرعت انجام گردد روشی است که مزیت ان کاسته می گردد و بهتر است که با روش 3 جایگزین گردد.

 

چند نکته جالب در کار با سمپلر

1- هرگز هنگام ریختن نمونه ها و یا محلول ها در میکروول ها سرسمپلر را به میکروولها نچسبانید زیرا بر اساس خاصیت چسبندگی سطحی مقدارمحلولی که داخل سر سمپلر می ماند نیز به داخل میکروول کشیده می شود و در نتیجه بر مقدار صحیح سمپلینگ خطا ایجاد میکند

2- در سمپلینگ حجمها ی 100 میکرولیتر و بیشتر بهتر است از روش سمپلینگ step2- step1 استفاده کنید تا هم سرعت سمپلینگتان افزایش یابد و هم ترسی از بابت اینکه حین کار حباب تشکیل شود و شما متوجه نگردید نداشته باشید.

3- برای هریک از اجزای کیت یک روش سمپلینگ را انتخاب نمایید و تا مصرف کامل کیت روش را تغییر ندهید به عنوان مثال اگر برای استانداردها روش step1-step1 را انتخاب کردید برای نمونه ها و کنترل ها هم step1-step1 را بکار ببرید و یا اگر برای ریختن محلول کنژوگه روش step2-step1 را انتخاب کردید دیگر انرا تا مصرف کامل کیت تغییر ندهید و رعایت کنید

کنترل کیفی سمپلر و سمپلینگ

 هنگامی که شما در ازمایشگاه سمپلر خود را کنترل کیفی می کنید در واقع به طور همزمان سمپلینگ خود را نیز کنترل کیفی کرده اید و در نهایت از حدود درستی کار با سمپلر نیز مظمئن می شوید.از انجایی که با هر سمپلر به 3 شیوه می توان کار کرد بنابراین جهت کنترل کیفی سمپلر یکی از روشها را انتخاب کنیدوتا انتهای عملیات کنترل کیفی سمپلر با همان شیوه پیش بروید. جهت کنترل کیفی سمپلر می بایست هم صحت و هم دقت سمپلر مورد ارزیابی قرار گیرد.جهت انجام کنترل کیفی از روش وزن سنجی به توسط یک ترازوی دیجیتالی دقیق و صحیح کالیبره با توان قرائت 4 رقم عشار استفاده کنید مایع مورد نظر را اب دیونیزه و دمای شرایط کنترل کیفی را 20 درجه انتخاب نمایید . به تعداد 20 مرتبه با سمپلر از اب دیونیزه بردارید و در یک میکرتیوب ریخته و هر بار انرا وزن نمایید در پایان داده ها را  پردازش نمایید و میزان عدم صحت و عدم دقت را که با شاخص های اماری BIAS% و CV% بیان می گردد تعیین نمایید. اگر شاخص های بدست امده در محدوده تعریف شده شرکت سازنده سمپلر بود نشانده هم کالیبره بودن سمپلر است و هم نشاندهنده درستی کاربر سمپلر ولی اگر شاخص های بدست امده در محدوده تعیین شده توسط شرکت سازنده سمپلر نبود یا بدلیل کالیبره نبودن سمپلر است و یا بدلیل عدم درستی کار با سمپلر . 


داستان مثبت کاذب در کیت الایزای hCG

یک نتیجه مثبت کاذب در تست hCG سبب چه مشکلاتی برای بیمار می شود؟

1- ابتدا خانم بیمار به بیمارستان مراجعه می کند تا x-RAY یا MRI انجام دهد که بصورت روتین بیمارستان دستور تست hCG می دهد تا مطمئن شود که خطری برای بچه وجود ندارد.وقتی یک نتیجه مثبت بدست می اید دکتر به حاملگی شک می کند و از بیمار می خواهد که 2 هفته بعد یک تست دیگر حامگلی بدهد.

2- بعد از 2 هفته بیمار برمی گردد در حالی که مقدار hCG افزایش نیافته است ( یک مورد false positive )  .دکتر به یک حاملگی خارج رحمی شک می کند و دستور ازمون ترانس واژینال اولتراسوند میدهد که می بایست بعد از 6 هفته وضعیت fetal sac قابل تشخیص باشد هنگامی که وضعیت مذکور شناسایی نمی گردد دکتر به حامگلی برون رحمی بیشتر مشکوک میشود . پزشک معالج به بیمار داروی متوتروکسات تجویز میکند تا حامگلی خارج رحمی را متوقف کند . درضمن ممکن است دکتر لاپاروسکوپی و ازمون اولتراسوند نیز تجویز نماید.

3- دکتر در چنین حالتی ممکن است ازمون dilation & curettage ( D & C  بدهد و انرا به پاتولوژیست بفرستد جهت بررسی از نظر وجود بافت مولار و بافت حاملگی هنگامی که پاتولوژیست جواب منفی را به پزشک معالج ارسال می دارد دکتر به وضعیت بسیار نادر کوریوکارسینوما شک می کند .

4- هنگامی که دکتر معالج اگاه می شود که بیمار قبلا نیز تجربه حاملگی داشته است درمان کوریوکارسینومای پس از حاملگی را درپیش میگیرد که شامل متوتروکسات و ادریومایسین و یا هیسترکتومی و اوو فورکتومی و برداشت دیگر بافت های مشکوک است و اگر همچنان سطح hCG بالا باقی بماند پزشک ممکن است کموتراپی را در دستور کار قرار دهد که منجر به کما و یا دیابت نوع 1 در فرد مورد نظر میگردد.

 


 

 








نظرات :
نام کاربری :
نام رمز :
 

آدرس این وب لاگ
 
gholamali nazary
ghnazary
آرشيو نوشته ها
1391/3   1390/6   1390/11  
1391/2   1390/5   1390/10  
1390/9   1390/4   1389/7  
1390/8   1390/3   1389/10  
پیوندها
کلیه حقوق معنوی و مادی این سایت برای شرکت تحقیقاتی تولیدی فارمد آوران سبز محفوظ است 2017®

پپتیدی, Bioinspiration, PerzischeGolf, تگومنت, Latent, اپتلیال, پپتیدی, كمپاني اسپينريكت, سانترومری, محیط های افتراقی, کوئینتانا, برناردسولیر, یکیویروس, تکنیک, نانوفناوری, آب سیب بنوشید, تشکیل باندهای پروتئین, احساس سیری, كاوشگرها, وارثتی, کربوهیدراته, نانوذرات, یاخته‌ای, نوکلئوتیدهای, کربنیل, نوکلئوتید, گوارشی, تخفیف‌ علایم‌ بواسیر, میکروتوم, رادیكال‌های, نخستین, كونژوگه, آزمایشگاه برای تولید خون مصنوعی, پرفوزیون, الیگومنوره, اصطلاحات بخش هماتولو‍‍‍زي, نانوباکتر, تشخیص قطعی كريپتوسپوريديوزي, شیستوزوما, پاراتورمون, متخصصان علوم ‌آزمایشگاهی, متفورمین, لایه پوشاننده معده, دکتری حرفه ای علوم آزمایشگاهی, G6PD, ترومبولیتیک, залив, CREATININE‌, Occupational, میلوما-, درمان آفتاب سوختگی کودک , هيدريشن, كلينيكي, الیزا, کاهش وزن, نانوبیو, سرطان حاد خون (لوسمی حاد), آمیلوئید, ضدعفونی, polymerase, کلرانفنیکل, اليمنتاسيون, کووت, ناشتا بودن , نانوالیاف, كلني هايي با جلاي فلزي سبز رنگ, بلاستیک, نمونه گیری , اکسیداسیون, قندخون,