در مورد تست الایزا elisa بدانيد

۱۳۹۱ چهارشنبه ۱۲ مهر 10:15 | Phasco-qc

نظرات : 3

  ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay يك روش آزمايشگاهي بيوشيميايي ساده با حساسيت بسيار بالا است كه امكان آناليز تعداد زيادي نمونه را به صورت همزمان فراهم مي كند. اين روش در ايمونولوژي (ايمني شناسي) براي تشخيص وجود يك آنتي بادي يا آنتي ژن در نمونه مورد آزمايش استفاده مي شود كه عموما به عنوان ابزاري تشخيصي در پزشكي و پاتولوژي و همچنين تست كنترل كيفيت در بسياري از صنايع كاربرد دارد. ELISA بر پايه اندازه گيري كمپلكس رنگي آنتي ژن و آنتي بادي استوار است. به اين ترتيب كه نمونه مورد آزمايش با مقدار نامشخصي آنتي ژن روي فاز جامد (معمولا پليت پلي استيرن) ريخته مي شود، سپس آنتي بادي بازيابي اضافه مي شود تا با آنتي ژن واكنش داده و تركيبي ايجاد كند. آنتي بادي بازيابي با آنزيم پيوندي كووالانسي برقرار مي كند. بين هر مرحله پليت با محلول پاك كننده ملايمي شسته مي شود تا هر پروتئين يا آنتي بادي باقيمانده شسته شود. پيش از آخرين مرحله شستشو، پليت با اضافه كردن زير لايه آنزيمي كشت داده مي شود و ماده رنگي توليد مي شود. طول موج رنگ به دست آمده توسط يك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت مي شود كه اين طول موج معرف حضور يك آنتي بادي يا آنتي ژن و نيز غلظت آن است. در ELISA هاي قديمي تر زيرلايه رنگ زا به كار گرفته مي شد در حاليكه در تست هاي جديدتر زيرلايه هاي فلوروژنيك با حساسيت بسيار بالاتر مورد استفاده قرار مي گيرد. امروزه ELISA يكي از قدرتمند ترين روش هاي آزمايشگاهي براي پي بردن به اختلالات سيستم ايمني است، اين تست به منظور پي بردن به آنتي ژن ناشي از ارگاني عفوني در بدن يا مواد غير نرمالي كه معرف برخي بيماري ها است انجام مي شود. همچنين آنتي بادي هايي كه در پاسخ به برخي عفونت ها يا بيماري ها به وجود آمده نيز توسط اين تست قابل تشخيص هستند. تست ELISA اولين آزمايش متداول در غربال زني HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقيق شده و به صفحه اي كه حاوي آنتي ژن HIV است اضافه مي شود. اگر آنتي بادي HIV در سرم وجود داشته باشد، به اين آنتي ژن هاي HIV مي چسبد. سپس به منظور از بين بردن ديگر اجزا سرم، پليت شستشو داده مي شود. يك "آنتي بادي ثانويه" ساخته شده مخصوص (يك آنتي بادي چسبيده به آنتي بادي ديگري) به پليت اعمال شده و شستشوي ديگري انجام مي شود. اين آنتي بادي ثانويه به صورت شيميايي به آنزيم از پيش تهيه شده مي چسبد. اين بار زير لايه اي براي آنزيم اعمال شده و توسط آنزيم كاتاليز مي شود كه منجر به تغيير رنگ در فلورسانس مي شود. نتايج ELISA به صورت عددي گزارش مي شود. بحث انگيزترين وجه اين تست تعيين نقطه برش بين نتايج مثبت و منفي است. علاوه بر آزمايش HIV از ELISA براي آزمايش بيماري هايي چون هپاتيت، تب استخوان شكن، leptospirosis ، عفونت انگلي، تبخال، سرخجه و ديگر عفونت هاي ويروسي و باكتريايي استفاده مي شود. پيش از پيدايش روش ELISA ، تنها گزينه براي انجام سنجش ايمني، ايمني سنجي راديويي بود، كه از آنتي ژن ها و آنتي بادي هايي كه به صورت راديواكتيو مميز شده بودند استفاده مي شد. در اين روش در صورت وجود آنتي بادي يا آنتي ژني خاص، راديواكتيويته سيگنالي توليد مي كرد. تئوري روش ايمني سنجي راديويي اولين بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجايي كه راديواكتيويته خطرات زيستي داشت، پيشنهاد امن تر و ايمن تري مبني بر جايگزيني سيگنال هاي غير راديو اكتيو به جاي سيگنال هاي راديو اكتيو ارائه شد. وقتي يك آنزيم مشخص (مانند پر اكسيداز) با زير لايه مناسب واكنش مي دهد، منجر به تغيير رنگ آن مي شود كه مي تواند به عنوان سيگنال استفاده شود. البته بايد تناسب بين سيگنال و وجود آنتي بادي يا آنتي ژن تعيين مي شد كه اين پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط Wide و Porath اين روش تكميل تر شد. و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهايتا به روش ELISA به شيوه امروزي دست پيدا كردند. ELISA امروزي مزاياي زيادي نسبت به روش هاي ايمني سنجي راديويي دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امكان اتوماسيون، امكان افزايش حساسيت روش، عمر طولاني كيت هاي آنزيمي، سرعت خوانش بالا و قيمت ارزان تر دستگاه ها و معرف ها. تست ELISA با روش هاي گوناگوني انجام مي شود كه كه به صورت كلي به دو دسته ELISA مستقيم و غير مستقيم تقسيم بندي مي شود. در روش مستقيم آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر به طور مستقيم بر سطح فاز جامد پوشش داده مي شود و سپس آنتي بادي يا آنتي ژن مكمل نشاندار شده آن به سيستم اضافه مي شود. با آناليز سيگنال توليد شده مي توان پي به وجود آنتي ژن يا آنتي بادي مورد نظر در نمونه برد. اين روش ارزش تشخيصي چنداني نداشته و بيشتر كاربرد تحقيقاتي دارد. در روش غير مستقيم سرم رقيق شده به آنتي ژن هاي پوشش داده شده در فاز جامد اضافه مي شود، سپس نمونه را به آن اضافه كرده و پس از گذشت زمان انكوباسيون و يك مرحله شستشو، آنتي هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهك اضافه مي شود. اين روش براي تعيين آنتي بادي اختصاصي يا تيتراسيون آنتي بادي در سرم استفاده مي شود. روش هاي ELISA ساندويچ و ELISA رقابتي يا مهاري از ديگر انواع متداول اين تكنيك هستند. روش ساندويچ كه متداول ترين روش ELISA است، يك آنتي ژن در بين دو آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد. روش هاي رقابتي نيز بر پايه رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي براي اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه كردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود، روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره زماني انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري مي نامند. مراحل انجام يك آزمون ELISA كه تقريبا در تمام انواع آن مشترك است عبارت است از: 1) پوشش دهي، كه به معني جذب يك آنتي ژن يا آنتي بادي با سطوح جامد است. 2) اضافه كردن نمونه هاي مورد آزمايش. 3) گذشت مدت زمان كافي براي انجام واكنش كه به اصطلاح انكوباسيون واكنشگرها ناميده مي شود. 4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا كردن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده . 5) اضافه عوامل لينك شده با آنزيم. 6) مجددا طي مدت زمان انكوباسيون براي واكنشگرها . 7)استفاده مجدد از واشر ELISA جهت انجام عمل شستشو . 8) افزودن زيرلايه آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده ها. 9) طي زمان انكوباسيون. 10) اتمام واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده ها و خوانش دانسيته نوري به دست آمده توسط خواننده .ELISA براي انجام تست ELISA بايد نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. براي اين كار بايد به مواردي دقت داشت. مثلا از بستن گارو براي مدتي طولاني بايد اجتناب كرد چرا كه ممكن است در پارامترهاي مورد اندازه گيري تاثير گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازي سرم نيز بايد دقت شود كه فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد. پيش از انجام آزمايش بايد به كيفيت كيت هاي مورد مصرف توجه كرد، همچنين نگهداري آن ها بايد در دماي C 8-2 صورت گيرد. تمامي محلول هاي موجود در كيت قبل از مصرف بايدخوب مخلوط شده و به دماي آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزايش پايداري، بلافاصله اجزاء كيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيري كرد. ايجاد پديده هوك باعث ايجاد نتايج پايين كاذب مي شود لذا توصيه مي شود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يك دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود. از آنجا كه فريز و ديفريز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخي از هورمون ها مي شود، بايد تا حد ممكن از اين كار پرهيز شود. پيش از اندازه گيري بايد كليه ابزارهاي مورد استفاده اعم از نوك ابزار نمونه گيري و كيت ها استريل شوند. كه البته استفاده از ابزارهاي يكبار مصرف پيشنهاد مي شود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش هاي شيشه اي آن ها را با اسيد سولفوريك رقيق شستشو داده و با آب مقطري كه دوبار تقطير شده آبكشي انجام داد. از به كار بردن محلول هاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد پرهيز كرد. ضمنا بايد از كاركرد صحيح دستگاه ها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فيلترهاي خواننده ELISA به كمك استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بيكرومات پتاسيم يا عملكردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان حاصل كرد.

نظرات

نظرات :