شناسايي باكتري استافيلوکوکوس اورئوس‌ توليد كننده انتروتوکسين تايپ C از نمونه‌هاي ناقلين سالم بوسيله PCR
 

- +
عنوان
ایمیل  
 

مهدي شيرازي[TEB AZMA] ارسال کننده
دكتر مجتبي سعادتي Ph.D _ بابك براتي M.Sc- مهدي شيرازي M.Sc نویسنده / نويسندگان
مترجم
شناسايي – استافيلوکوکوس اورئوس – انتروتوکسين تايپ C - PCR کلید واژه
زمينه و هدف: استافيلوكوكوس اورئوس يک پاتوژن فرصت طلب است که در شرايط مساعد قادر به ايجاد عفونت در انسان و حيوان مي باشد. اين باكتري مي‌تواند با رشد در مواد غذايي و توليد انتروتوکسين سبب مسموميت غذايي در انسان شود. انتروتوكسين‌ از دستگاه گوارش به سيستم گردش خون وارد ‌شده، مركز عصبي غيرارادي استفراغ را تحريک نموده و باعث ايجاد حالت تهوع، استفراغ، دل‌پيچه و اسهال در فرد مسموم مي‌شود. تنها برخي از سويه‌هاي استافيلوکوکوس اورئوس توانايي توليد انتروتوکسين و ايجاد مسموميت غذايي را دارند که با استفاده از روش‌هاي تكثير DNA (واكنش‌هاي زنجيره‌اي پليمراز PCR) مي‌توان حضور سويه‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس انتروتوكسوژنيك را بر اساس توالي اختصاصي ژن قبل از توليد انتروتوكسين نشان داد. مواد و روش ها: در اين مطالعه با استفاده از سوآب استريل از 150 نفر حمل كننده باكتري از طريق بيني، 95 سويه‌ استافيلوكوكوس اورئوس جداسازي شدندكه با آزمايش‌هاي بيوشيميايي شناسايي و تاييد شدند و با طراحي پرايمر براي ژن نوكلئاز مقاوم به حرارت استافيلوكوكي (nuc) و تکثير آن با واکنش PCR اقدام به شناسايي مولکولي باکتري نيز گرديد. سپس با پرايمرهاي طراحي شده براي ژن‌ انتروتوكسين استافيلوكوكي تايپC (sec) و تکثير در واكنش PCR، اقدام به شناسايي سويه‌هاي انتروتوکسوژنيک تايپ C گرديد. يافته ها: قطعات تكثير يافته DNA براي ژن نوكلئاز استافيلوكوكي bp397 و براي ژن انتروتوكسين تايپC استافيلوكوكي bp271 بود كه توسط هضم آنزيمي و تعيين توالي قطعه تکثير شده مورد تاييد قرار گرفت. از همه سويه هاي مورد مطالعه، تنها5/9% سويه جدا شده حاوي ژن sec بودند. ژن nuc که کد کننده آنزيم نوکلئاز مقاوم به گرما مي باشد به عنوان DNA هدف جهت شناسايي استافيلوكوكوس اورئوس مورد استفاده قرار گرفت. اختصاصيت و حساسيت واکنش نيز مورد ارزيابي قرار گرفت که حساسيت آن 125 سلول تعيين گرديد. نتيجه گيري: اين روش سريع، حساس، اختصاصي، ارزان و متدي متفاوت نسبت به سنجش‌هاي مرسوم بيوشيميايي و سرولوژيکي بوده و قادر است عامل توليد كننده انتروتوكسين تايپ‌C استافيلوكوكي را شناسايي نمايد. چکیده
دانشگاه علوم پزشكي بقيه ا... (عج)- مركزتحقيقات بيوتكنولوژي كاربردي و محيط زيست - ارسالی از طرف کاربر TEB AZMA منابع
. .
 
شناسايي باكتري استافيلوکوکوس اورئوس‌ توليد كننده انتروتوکسين تايپ C از نمونه‌هاي ناقلين سالم بوسيله PCR


مقدمه

باکتري استافيلوکوکوس اورئوس يکي از عوامل فرصت طلب بيماري زا مي باشد که در شرايط مساعد قادر است ايجاد عفونت در انسان و حيوان نمايد. اين باكتري علاوه بر آن مي‌تواند موجب مسموميت غذايي در افراد نيز گردد. استافيلوکوکوس اورئوسn , SEB ,SEA توليد مي شود (2،3و4). اخيرا انتروتوکسين هاي مانند SEG, SEI, SEH, و SEQ ,SEP ,SEO ,SEN ,SEM ,SEL ,SEK ,SEJ , با روش هاي جديد مورد شناسايي قرار گرفته است (5، 6، 7، 8 و 9). تحقيقات فراواني در مورد انتروتوکسين‌هاي توليد شده توسط استافيلوکوکوس اورئوس انجام شده است و تا کنون بيش از 14نوع انتروتوکسين مختلف که ساختمان و توالي نسبتاً يکساني دارند گزارش شده است (10، 11 و 12). عوامل حدت زايي را ترشح مي‌کند که در استقرار و بيماريزايي اين باکتري در ميزبان‌هاي پستاندار دخالت دارند (1). يکي از اين عوامل انتروتوکسيني است که توسط سويه هاي مختلف اين باکتري SEE, SED, SEC

محل قرار گرفتن ژن‌هاي انتروتوکسين‌ها متفاوت است. برخي همچون sej و sec1 درون پلاسميد واقع شده‌اند درحالي که sei, sem, sen و seo در کروموزوم و به صورت گروهي قرار گرفته‌اند. ژن sea در پروفاژ و ژن see در فاژهاي ناقص واقع شده است و ژن‌هاي sek و sel در جزاير پاتوژنيسيته جايي گرفته‌اند. برخي از ژن‌هاي انتروتوکسين استافيلوکوکي در چند محل قابل مشاهده هستند به طور مثال ژن seb در کروموزوم ، پلاسميد و ترانسپوزون واقع شده است (11 و 13). ژن کد کننده انتروتوکسين تايپC در جزاير پاتوژنيسيته قرار دارد (14)

براي سروتايپ SEC چندين اختلاف آنتي ژنيک و مولکولي مانند SEC1 (15) SEC2 (16) وSEC3 (17 و 18) گزارش شده است

انتروتوكسين‌هاي استافيلوكوكي پروتئين‌هايي با وزن مولكولي 29-26 کيلودالتون هستند كه به وسيله استافيلوكوك كواگولاز مثبت توليد مي‌شوند (3 و 10). مهم ترين خصوصيات انتروتوکيسن‌ استافيلوکوکي ، توانايي ايجاد استفراغ در پريمات‌ها، مقاومت به حرارت و هضم پپسين و خاصيت سوپرآنتي‌ژنيسيته است (19). علائم مسموميت با انتروتوكسين‌هاي استافيلوكوكي در انسان شامل افزايش بزاق دهان، تهوع، استفراغ و سپس دل‌پيچه و اسهال كه در برخي موارد همراه با خون نيز ديده مي‌شود، مي باشد (2). تقريبا 5 درصد مسموميت هاي غدايي، ناشي از انتروتوکسين هاي توليد شده توسط اين باکتري مي باشد (20). اين در حالي است که گزارش مسموميت هاي ناشي از اين انتروتوکسين به دليل شناسايي تايپ هاي جديد رو به افزايش است (12 و 8) هر چند در ايران اطلاعات دقيقي در اين خصوص تا کنون گزارش نشده است. Bergdoll (1982) گزارش نمود که 95 درصد مسموميت هاي ناشي از انتروتوکسين استافيلوكوكوس اورئوس به علت تايپ هاي A، B، C، D و E بوده و 5 در صد باقي مانده به علت ديگر تايپ هاي اين باکتري مي باشد (21). انتروتوکسين تايپ A استافيلوکوکي مهمترين انتروتوکسين توليد شده توسط استافيلوکوک کواگولاز مثبت است اين سم عامل اصلي مسموميت‌هاي غذايي استافيلوکوکي در دنيا بوده و بيشترين مطالعات نيز در مورد آن انجام شده است هر چند انتروتوکسين تايپ B به علت قابليت جذب از طريق استنشاق و کاربردهاي بيوتروريستي نيز مورد توجه محققين بوده است (10 و 22). اين درحالي است که کمترين اطلاعات در خصوص انتروتوکسين هاي توليد شده توسط ديگر سوش ها وجود دارد.

روش‌هاي مختلفي براي شناسايي سم اين باكتري از جمله لاتکس آگلاتيناسيون، الايزا، ايمونوديفوژن و راديو ايمنواسي وجود دارد كه در همه اين روش‌ها نياز به فراهم شدن شرايطي براي بيان شدن ژن انتروتوکسين استافيلوکوکي مي‌‌باشد (11، 22 و 23). اين در حالي است که ممکن است باکتري در شرايط خاص عليرغم داشتن ژن توليد کننده سم قادر به توليد آن نبوده و نتايح بدست آمده در روش هاي فوق الذکر را منفي گرداند. لذا تلاش محققين بر آن شد تا روش‌هاي تشخيص مولکولي را جانشين روش هاي بيوشيميايي و سرولوژيکي نمايند. در روش مولکولي که با شناسايي ژن کد کننده سم انجام مي شود مي توان نسبت به شناسايي استافيلوکوک‌هايي که ژن کد کننده اين سم را شناسايي نمود هر چند اين روش مي تواند سوش هايي که به ميزان کم سم را ترشح نموده و در روش‌هاي ايمنولوژيکي نمي‌توان اين سموم را شناسايي نمود اقدام به شناسايي آنها نمود. (22، 24 و 25). هدف از اين تحقيق جداسازي باکتري استافيلوكوكوس اورئوس‌ و شناسايي سويه‌هاي واجد ژن كدكننده انتروتوكسين تايپ C به وسيله PCR بود. اين اولين بار است كه در ايران اين تايپ شناسايي و گزارش مي شود

مواد و روش‌ها


آنزيم Taq DNA polymerase ، آنزيم‌هاي محدودالاثر و ماركر 100 bp DNA ladder از شركت Fermentase خريداري شد. Tris-base، EDTA ، dNTP، MgCl2، RNAse، اتيديوم برومايد و ليزوزيم از شركت سيناژن تهيه گرديد. باكتري‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس(ATCC=25923)،استافيلوكوكوس اپيدرميديس و استرپتوكوكوس پيوژنز از آزمايشگاه رفرانس ايران تهيه شدند. ميكروكوكوس لوتئوس (ATCC=9341) ، باسيلوس پلي‌ميگسا 8094) (ATCC= ، باسيلوس سرئوس (ATCC= 11778)، سالمونلا پاراتيفيA (NCTC=5702)، يرسينيا سودوتوبركلوزيس (PCTC=1070)، پروتئوس ولگاريس سويه ox19 (ATCC=6380)، و باكتري اشريشيا كلي نيز از سازمان پژوهش‌هاي علمي و صنعتي ايران تهيه گرديدند. باكتري توليد كننده انتروتوكسين تايپ A استافيلوكوكوس اورئوس از دانشگاه امام حسين (ع) تهيه شد.‌

در اين تحقيق 150 نمونه از مخاط بيني افراد (ناقلين سالم)، نمونه برداري شد. سوآب نمونه برداري شده درون محيط کشت مانيتول سالت آگار كشت و سپس به وسيله آزمايش‌هاي بيوشيميايي تعيين هويت گرديد.

پرايمرهاي مورد استفاده:

با استفاده از توالي ژن‌هاي nuc وsec در بانک‌هاي ژني به طراحي دو جفت پرايمر براي ژن‌هاي آنزيم دزکسي‌ريبونوکلئاز (nuc) که شاخصي براي شناسايي استافيلوکوکوس اورئوس نيز مي‌‌باشد و انتروتوکسين استافيلوکوکي تايپC (sec) اقدام گرديد. پس از انتخاب پرايمرهاي مورد نظر، به وسيله نرم‌افزارهاي مولكولي (DNASIS, BLAST, Oligo) وجود لوپ، دماي ذوب و ساير خصوصيات پرايمرها مورد بررسي قرار گرفت. به دنبال تأييد خصوصيات، پرايمرها جهت ساخت به شركت MWG آلمان سفارش داده شد. پس از ساخته شدن پرايمرها و قبل ازاستفاده در واكنش PCR كيفيت آنها با الکتروفورز بر روي ژل 15درصد پلي اكريل آميد نيز مورد بررسي قرار گرفت. در اين تحقيق از پرايمر هاي sea F ، sea R و IpaH F به عنوان كنترل استفاده گرديد. اين پرايمرها عبارت بودند از:




nucF: 5'- CTG GCA TAT GTA TGG CAA TTG -3'

nucR: 5'- AAT GCA CTT GCT TCA GGA CC-3'

secF : 5' CTC AAG AAC TAG ACA TAA AAG CTA GG -3'

secR : 5' TTA TAT CAA AAT CGG ATT AAC ATT ATC -3'

seaF : 5'TTG CGA AAA AAG TCT GAA TTG C -3' (به عنوان كنترل مورد استفاده قرار گرفت)

seaR: 5'ATT AAC CGA AGG TTC TGT AGA AGT A -3' (به عنوان كنترل مورد استفاده قرار گرفت)

IpaH F: 5' CCT TGA CCG CCT TTC CGA TA -3' (به عنوان كنترل مورد استفاده قرار گرفت)


تخليص ژنوم

پس از كشت باكتري نسبت به تخليص ژنوم آن اقدام گرديد. استخراج ژنوم به روش قليايي انجام شد و ژنوم‌هاي تخليص شده در دماي 4 درجه سانتي‌گراد نگهداري شدند. جهت بررسي کيفيت محصول تخليص شده، DNA ژنومي روي ژل آگارز يک درصد الكتروفورز شد. براي اندازه گيري غلظت DNA نيز از دستگاه UV spectrophotometer و جذبهاي nm260 و nm 280 استفاده گرديد.

واكنش PCR:

واكنش در حجم نهايي 25 ميكروليتر انجام گرديد در اين واکنش 1 ميكروليتر از DNA الگو، 5/0 ميکروليتر از آنزيم Taq DNA polymerase (5 واحد در ميکروليتر)، 5/0 ميکروليتر از هر پرايمر (20 پيکومول در ميکروليتر)، 2 ميکروليتر از مخلوط دزوكسي نوكلئوتيدهاي تري‌فسفات (5/2 ميلي‌مولار) ، 5/2 ميكروليتر بافر x) PCR 10) و 5/1 ميکروليتر از نمك MgCl2 ( 50 ميلي‌مولار) با يكديگر مخلوط و حجم نهايي با آب دوبار تقطير به 25 ميكروليتر رسانده شد. واكنش در 32 سيكل مطابق جدول شماره 1 انجام گرديد. جهت بررسي محصول واكنش، 5 ميكروليتر از آن جهت الکتروفورز روي ژل آگاروز 1 درصد انتقال داده شد سپس با اتيديوم برومايد رنگ آميزي و مورد ارزيابي قرار گرفت. جهت تاييد محصولات بدست آمده در واكنش فوق به منظور تعيين توالي، ابتدا 50 ميكروليتر از قطعه تكثير شده توسط كيت تخليص محصول PCR شركت Fermentas تخليص شد و فرآيند تعيين توالي توسط شرکت زيست فناوري كوثر انجام گرفت.

تعيين ميزان اختصاصيت و حساسيت واكنش ‍: PCR

براي تعيين اختصاصيت، واكنش PCR با ژنوم تخليص شده 11 باكتري شامل سوش‌هاي ميكروكوكوس لوتئوس ، استرپتوكوكوس پيوژنز ، باسيلوس سرئوس، باسيلوس پلي‌ميگسا، سالمونلا پاراتيفيA ، يرسينيا سودوتوبركلوزيس، اشريشيا کلي، پروتئوس ولگاريس، سويه‌هاي استافيلوکوکوس اورئوس تايپ A و استافيلوكوكوس اپيدرميديس انجام شد.

ميزان حساسيت واكنش طراحي شده بر اساس تعداد باكتري محاسبه گرديد. براي محاسبه حساسيت واكنش بر اساس تعداد باكتري، پس از كشت باكتري در محيط آبگوشت مغذي، ابتدا از محيط مورد نظر تا 9-10 رقت (15سلول در ميکروليتر) تهيه كرده و براي تمامي رقت ها واكنش PCR انجام شد و جهت محاسبه تعداد باكتري در هر رقت فرآيند شمارش باكتري (Colony count) انجام گرفت.

يافته ها

در اين تحقيق 150 نمونه مورد بررسي قرار گرفت كه 95 نمونه استافيلوکوکوس اورئوس با استفاده از روش هاي بيوشيميايي مورد شناسايي قرار گرفت. سپس نسبت به استخراج DNA و آزمايش PCR با استفاده از پرايمرهاي تهيه شده اقدام گرديد.

از ژل الکتروفورز جهت مشاهده ژنوم و بررسي کيفيت تخليص استفاده گرديد، پس از گذشت 60 دقيقه از زمان الكتروفورز، نتيجه حاصل از الكتروفورز مطابق تصوير شماره 1 مورد بررسي قرار گرفت. عدم وجود باندهاي اضافي، نشان دهنده تخليص نسبتاََ مناسب DNA ژنوميك باكتري هاي ذكر شده مي‌باشد

كيفيت پرايمرهاي سفارش داده شده با الکتروفورز بر روي ژل 15درصد پلي اكريل آميد نيز مورد بررسي قرار گرفت. (تصوير شماره 2، رديف هاي 1، 2، 3 و 4) در اين تحقيق از پرايمر هاي sea F ، sea R و IpaH F به عنوان كنترل استفاده گرديد (تصوير شماره 2، رديف هاي 5، 6 و 7)

براي جستجوي استافيلوکوکوس اورئوس انتروتوکسوژنيک تايپ C واکنش PCR با دو جفت پرايمر ويژه ژن‌هاي nuc و sec انجام شد که وجود قطعه 397جفت باز مربوط به تکثير بخشي از ژن nuc، نشان دهنده وجود اين ژن در باکتري استافيلوکوکوس اورئوس بود که از اين طريق نسبت به شناسايي اين باكتري اقدام گرديد (تصوير شماره 3 ستون 5) و وجود قطعه 271جفت باز نيز مربوط به تکثير بخشي از ژن sec بود که وجود ژن کد کننده انتروتوکسين تايپC را تاييد مي‌نمود (تصوير شماره 3 ستون 4). جهت شناسايي همزمان باكتري استافيلوكوكوس اورئوس و تايپ نمودن از روش multiplex PCR استفاده شد (تصوير شماره 3 ستون 2). كه در اين روش علاوه بر شناسايي باكتري نسبت به تايپ آن نيز در يك زمان اقدام مي گردد.

نتايج واکنش PCR از ژنوم اين باکتري‌ها نشان داد كه 5/9 درصد از افراد ناقلين سالم استافيلوکوکوس اورئوس تايپ C بوده و بقيه (5/90 درصد) فاقد ژن انتروتوکسين تايپ C بودند.

اختصاصيت و حساسيت واكنش

جهت تعيين ميزان اختصاصي بودن واكنش PCR، نسبت به انجام واكنش PCR با باكتري‌هاي ميکروکوکوس لوتئوس ATCC=9341، استرپتوکوکوس پيوژنز ( آزمايشگاه رفرانس)، باسيلوس سرئوس ، باسيلوس پلي ميکسا، سالمونلا پاراتيفي، يرسينيا سودوتوبرکلوزيس ، اشريشيا کلي، پروتئوس ولگاريس ، استافيلوکوکوس اپيدرميديس ، استافيلوکوکوس اورئوس اقدام گرديد. نتيجه حاصل از الكتروفورز در تصوير شماره 4 مورد بررسي قرار گرفت. همانگونه كه در تصوير مشاهده مي‌شود واكنش در مورد استافيلوکوکوس اورئوسي كه داراي ژن كد كننده انتروتوكسين تايپ C مي باشد صورت گرفته است (تصوير شماره 4 ستون هاي 12 و 14). اين درحالي است كه اين واكنش با باكتري هاي استافيلوكوكوس اورئوسي كه فاقد اين ژن بود و به عنوان كنترل منفي مورد استفاده قرار گرفت انجام نشده است (تصوير شماره 4 ستون هاي 11 و 15). در مورد ديگر باكتري‌ها مورد بررسي نيز واكنشي صورت نگرفته (تصوير شماره 4 ستون هاي 2، 3، 4، 5، 7، 8، 9، 10 و 13) كه نشان از اختصاصي بودن پرايمرهاي مورد استفاده در اين تحقيق را دارد

به منظور بررسي حساسيت روش شناسايي مولكولي استافيلوكوكوس اورئوس، پس از کشت و شمارش نسبت به تهيه رقت از باکتري اقدام گرديد. از رقت‌هاي تهيه شده (4000، 2000، 1000، 500، 250، 125، 60 ، 30 و 15سلول در ميکروليتر) باکتري استافيلوکوکوس اورئوس که واجد ژن کد کننده انتروتوکسين تايپ C بود واکنش PCR صورت گرفت که نتايج آن در تصوير شماره 5 نشان داده شده است.

همان گونه که در تصوير شماره 5 مشخص است واکنش PCR براي رقت‌هاي 125 سلول و بيشتر از آن انجام گرديد و محصول واکنش PCR آنها بر روي ژل آگارز 1 درصد ايجاد قطعه 271جفت باز به خوبي قابل تشخيص بود (ستون‌هاي 2، 3، 4، 5، 6 و 7). اين در حالي بود که براي کمتر از 125 باکتري در واکنش PCR هيچ گونه قطعه‌اي بر روي ژل آگارز مشاهده نشد (ستون‌هاي 8، 9 و 10). لذا حد تشخيص اين روش با استفاده از نمونه‌هاي مستقيم حدود 125 سلول تعيين گرديد (تصويرشماره 5 ستون 7). از نشانگر وزن مولکولي bp100 نيز در ستون 1 استفاده شد.

به منظور اطمينان از تكثير قطعه مورد نظر، نسبت به تعيين توالي قطعه 271جفت باز تکثير يافته نيز اقدام گرديد. نتايج تعيين توالي قطعه تكثير شده كه توسط شرکت زيست فناوري كوثر انجام گرفت نيز با توالي ژن sec به طور كامل هم‌خواني داشته و صحت وجود ژن sec در سويه‌هاي شناسايي شده تاييد گرديد.

به منظور بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي اين باكتري نسبت به تست حساسيت اقدام گرديد در اين تحقيق از 11 نوع آنتي بيوتيك استفاده شد كه با توجه به نتايج بدست آمده، باكتري استافيلوكوكوس اورئوس تايپ C مقاوم به آنتي بيوتيك هاي متي سيلين، آموكسي سيلين، كلوكساسيلين و پني سيلين مي باشد اين در حالي است كه باكتري نسبت به آنتي بيوتيك هاي لينكومايسين، تتراسيكلين، وانكومايسين، كلرامفنيكل و اريترومايسين حساس مي باشد (جدول شماره 2)

بحث

باکتري استافيلوکوکوس اورئوس قادر به توليد پروتئين‌هاي مختلفي است. يکي از اين پروتئين‌ها انتروتوکسين مي‌باشد که مي‌تواند ايجاد مسموميت غذايي در افراد نمايد. بيشترين مطالعه و توجه محققين به انتروتوکسين‌هاي تايپ A و B بوده است. چرا که در بين سروتايپ‌هاي استافيلوکوکي بيشترين گاستروانتريت توسط اين دو تايپ ايجاد شده است. اين در حالي است كه مطالعات كمتري در مقايسه با دو تايپ فوق در خصوص ديگر تايپ هاي اين باكتري از جمله تايپ C انجام شده است. هر چند تايپ C هم از انسان و هم از حيوانات جداسازي شده است.

Klotz و همکاران در ماربورگ آلمان در سال 2003 سويه‌هاي جداسازي شده از مدفوع بيماران بيمارستان‌ها در طول 5 ماه را مورد آزمايش قرار داده و با کمک تکنيک multiplex PCR مشخص نمودند که 44 سويه از 93 سويه استافيلوکوکوس اورئوس(31/47 درصد) جداسازي شده واجد ژن‌هاي کد کننده انتروتوکسين‌هاي مختلف بوده که 51/21 درصد واجد ژن sec بودند (14). در کشور ترکيه Bystron و همکاران در سال 2005 تعداد 65 نمونه از غذاهاي تهيه شده از مرغ‌هاي نيم پخته را به وسيله تکنيک multiplex PCR جهت شناسايي استافيلوکوکوس اورئوس‌هاي توليد کننده انتروتوکسين مورد آزمايش قرار دادند و 11 سويه از باکتري استافيلوکوکوس اورئوس انتروتوکسوژنيک را شناسايي و جداسازي نمودند (26). در جمهوري اسلواکي Beata Holeckova و همکاران در سال 2002 در بررسي نمونه‌هاي غذايي مختلف (سوسيس و انواع سوپ‌هاي رشته‌اي ) تعداد43 سويه استافيلوکوکوس اورئوس را شناسايي و جداسازي نمودند که 15 سويه (88/34 درصد) از استافيلوکوکوس اورئوس‌ها پس از آزمايش multiplex PCR انتروتوکسوژنيک شناخته شدند. از اين 15 باکتري 7 سويه ( 28/16 %) واجد ژن کد کننده انتروتوکسين تايپ بودند. در اين تحقيق از سوآب بيني و گلو توليد کنندگان پنير گوسفندي 19 سويه استافيلوکوکوس اورئوس جداسازي شد که يکي از اين سويه‌ها (26/5 درصد) واجد ژن sea بودند(18). در مطالعه اي که در سال 2000 توسط ZschoK ck و همکارانش بر روي گاوهاي مبتلا به تورم پستان انجام دادند، 94 سويه استافيلوكوكوس اورئوس جدا نموده و نشان داده اند که 22 سويه واجد ژن sec بودند در اين مطالعه آنها نتوانستند سويه واجد ژن see را پيدا نمايند (35). اگرچه انتروتوکسين ها از نظر ساختماني و بيولوژيکي مشابه مي باشند اما مقدار توليد سم در بين اين تايپ ها متفاوت است (36). مقدار بيان انتروتوکسين تايپ B و C بيش از ديگر انتروتوکسين ها گزارش شده است. Bergdoll در سال 1979 نشان داد که مقدار ترشح انتروتوکسين تايپ A و D کمتر از انتروتوکسين B و C مي باشد (37) اين در حالي است که Klotz و همکارانش درسال 2003 گزارش کردند مقدار انتروتوکسين تايپ B و C از لحاظ ژنوتيپي و فنوتيپي تقريبا يکسان مي باشد (14).

در اين تحقيق از 150 نمونه استافيلوكوكوس مورد آزمايش 95 سويه به عنوان استافيلوکوکوس اورئوس شناسايي شدند. بدين معني که 37/70 درصد ناقلين سالم استافيلوکوکوس اورئوس تشخيص داده كه از اين تعداد 5/9 درصد واجد ژن sec بودند. به طور كل از 95 سويه استافيلوكوكوس اورئوس تنها 9 سويه واجد ژن انتروتوكسين استافيلوكوكي تايپ C بوده كه تقريباًکمتر از نصف فراواني بدست آمده در تحقيق Zschock, و همکاران در سال2000 و نيز Kenny و همکارانش در سال 1993 است. علت عمده تفاوت‌ها در ميزان فراواني سويه‌هاي انتروتوکسوژنيک تايپ C در اين تحقيق با ساير محققين و همچنين تفاوت اين فراواني‌ها در گزارشات مختلف، مي تواند مربوط به منشاء جداسازي باکتري باشد. ميزان فراواني سويه‌هاي استافيلوکوکوس اورئوس انتروتوکسوژنيک تايپ C با منشاء حيوان، انسان، عفونت‌ها، غذا و يا محيط متفاوت است (24 و 25) که البته در هر يک از موارد فوق نيز تفاوتهاي وجود داشته به طوري که اين ميزان در انواع غذاها و عفونتهاي مختلف، متفاوت گزارش شده است (38و39)

در بسياري از تحقيقات انجام شده از روش‌هاي مختلف PCR جهت شناسايي ژن‌هاي کد کننده انتروتوکسين‌هاي استافيلوکوکي در مواد غذايي مختلف استفاده شده و واکنش بهينه گرديده تا حساسيت واکنش در نمونه‌هاي غذايي مختلف به بالاترين سطح ممکن برسد. به طور مثال براي شناسايي ژن‌هاي کد کننده انتروتوکسين استافيلوکوکي در شير خشک ميزان حساسيت را 1000 باکتري تعيين کردند.( 40 و 41) اين در حالي است كه حساسيت بدست آمده در اين تحقيق برابر 125 باكتري است. علت حساسيت نسبتاً خوب اين تحقيق،شناسايي باکتري در محيط بافري است اما چنانچه باکتري در مواد غذايي مورد آزمايش قرار گيرد (به طور مثال شير خشک) به علت وجود مواد ممانعت کننده در ماده غذايي ميزان حساسيت ممکن است کمتر باشد(42).

از آنجا كه مقاومت هاي ميكروبي هر روز بيشتر مي شود مقاومت آنتي بيوتيكي استافيلوكوكوس اورئوس تايپ C در اين تحقيق مورد بررسي قرار گرفت و مشاهد گرديد كه اين باكتري به متي سيلين مقاوم بود. ميزان مقاومت به اين آنتي بيوتيك در كشور هاي مختلف متفاوت مي باشد بطور كه كمتر از 1 درصد تا 60 درصد متغيير گزارش شده است (43 و 44) از آنجا كه اين باكتري مقاوم مي تواند در بيماران مشكلاتي را ايجاد نمايد لذا توجه به اين مسئله در درمان بيماران از اهميت ويژه اي برخوردار مي باشد

تشكر و قدرداني:

از جناب آقاي دكتر سلطان پور مسئول محترم آزمايشگاه بيمارستان بقيه ا.... وهمكار ايشان سركار خانم مجيدي به جهت كمك در انجام اين تحقيق كمال تشكر را داريم.


References

1- Dinges M. M., Dinges P., Orwin M and Schlievert P. (2000). Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev. January; 13(1): 16–34

2- Balaban N and Rasooly A (2000). Staphylococcal enterotoxins. Int. J. Food Microbiol. 61: 1-10.

3- Jacek B, Anna D, Jarosaaw B. (2006). Distribution of newly described enterotoxin-like genes in Staphylococcus aureus from food. Inter J Food Microbiology. 108 :36 – 41

4- Lowy F. D. (1998). Staphylococcus aureus infection. N Engl J Med. 339:520-532

5- Su, Y.C. and Wong, A.C.L. (1995). Identification and purification of a new staphylococcal enterotoxin H. Appl. Environ. Microbiol. 61:1438–1443.

6- Munson, S. H., Tremaine, M.T. M., Betley, J. and Welch, R.A. (1998). Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 66:3337–3348.

7- Jarraud, S., Cozon, G., Vandenesch, F., Bes, M., Etienne, J. and Lina, G. (1999). Involvement of enterotoxin G and I in staphylococcal toxic shock syndrome and staphylococcal scarlet fever. J. Clin. Microbiol. 37:2446–2449

8- Omoe K., Ishikawa M., Shimoda Y., Hu D., Ueda S. and Shinagawa K. (2002). Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus Isolates and Determination of the Enterotoxin Productivities of S. aureus Isolates Harboring seg, seh, or sei Genes . Journal of Clinical Microbiology. 40:857-862.


9- Sergeev, N., Volokhov, D., Chizhikov, V. & Rasooly, A. (2004). Simultaneous analysis of multiple staphylococcal enterotoxin genes by an oligonucleotide microarray assay. J Clin Microbiol 42:2134–2143

10- Loir Y. L., Baron F. and Gautier M. (2003). Review Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and Molecular Research. 2 :63-76

11- Orwin P. M., Fitzgerald J. R., Leung D. Y. M., Gutierrez J. A., Bohach G. A. and Schlievert P. M. (2003). Characterization of Staphylococcus aureus Enterotoxin L. Infect. Immun. 71: 2916-2919

12- Rosec J. P. and Gigaud O. (2002). Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France. Int. J. Food Microbiol. 77:61-70.

13- Iandolo J. J. (1989). Genetic analysis of extracellular toxins of Staphylococcus aureus. Annu. Rev. Microbiol. 43:375-402

14- Klotz M., Opper S., Heeg K. and Zimmermann S. (2003). Detection of Staphylococcus aureus Enterotoxins A to D by Real-Time Fluorescence PCR Assay. J. Clin. Microbiol. 41:4683-4687

15- Bohach G. A. and Schlievert P. M. (1987). Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins. Mol. Gen. Genet. 209:15–20.

16- Avena R. M. and Bergdoll M. S. (1967). Purification and some physicochemical properties of enterotoxin C Staphylococcus aureus strain. 361. Biochemistry 6:1474–1480.

17- Reiser R. F., Robbins R. N., Noleto A., Khoe G. P. and Bergdoll M. S. (1984). Identification, purification, and some physicochemical properties of staphylococcal enterotoxin C3. Infect. Immun. 45:625–630.

18- Marr J. C., Lyon J. D., Roberson J. R., Lupher M., Davis W. and Bohach G. A. (1993). Characterization of novel type C staphylococcal enterotoxin: biological and evolutionary implications. Infect. Immun. 61:4254–4262.

19- Hawryluk T. and Hirshfield I. (2002). A superantigen bioassay to detect staphylococcal enterotoxin A. J. Food Prot. Jul; 65 (7):1183-7.

20- Kokan N. P. and Bergdoll M. S. (1987). Detection of low-enterotoxin-producing Staphylococcus aureus strains. Appl. Environ. Microbiol. 53:2675–2676

21- Bergdoll M. S. (1983). Enterotoxins, p. 559-598. In C. S. F. Easton and C. Adlam (ed.), Staphylococci and staphylococcal infections. Academic Press, London, United Kingdom.

22- Evenson M. L., Hinds M. W., Bernstein R. S. and Bergdoll M. S. (1988). Estimation of human dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk. Int. J. Food Microbiol. 7:311-316.

23- Park C. E., Akhtar M. and Rayman M. K. (1992). Nonspecific reactions of a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit (TECRA) for detection of staphylococcal enterotoxins in foods. Appl Environ Microbiol. August; 58(8):2509–2512.

24- Cremonesi P., Luzzana M., Brasca M., Morandi S., Lodi R., Vimercati C., Agnellini D., Caramenti G., Moroni P. and Castiglioni B. (2005). Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products. Mol Cell Probes. 19:299-305

25- Najera-Sanchez G., Maldonado-Rodriguez R., Ruiz Olvera P. and Garza L. M. (2003). Development of two multiplex polymerase chain reactions for the detection of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from foods. J Food Prot. 66:1055-1062.

26- Bystron J., Molenda J., Bania J. and Czerw M. (2005). Occurrence of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus in raw poultry meat. Polish Journal of Veterinary Sciences . 8, pp 37-40

27- Holeckova B., Holoda E., Fotta M., Gondol J. and Grolmus J. (2002) . Occurrence of enterotoxinic Staphylococcus aureus in food . Ann Agric Environ Med 9:179–182

28- Rutthrobbins B. (1974). Detecting the entrotoxigenicity of Staphylococcal. Appl Microbiol. Dec: 946-950

29- Park C. E., Akhtar M. and Rayman M. K. (1993). Simple Solutions to False-Positive Staphylococcal Enterotoxin Assays with Seafood Tested with an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit (TECRA) . Applied and Environmental Microbiology. July: 2210-2213

30- Johnson W. M., Tyler S. D., Ewan E. P., Ashton F. E., Pollard D. R. and Rozee K. R. (1991). Detection of Genes for Enterotoxins, Exfoliative Toxins, and Toxic Shock Syndrome Toxin 1 in Staphylococcus aureus by the Polymerase Chain Reaction. J. Clin. Microbiol. 29:426-430

31- Cortez A. L., Carvalho A. C., Ikuno A. A., Burger K. P. and Vidal-Martins A. M. (2006). Identification of Salmonella spp. isolates from chicken abattoirs by multiplex-PCR. Res Vet Sci. 13.

32- Garcia A. B., Blesa S., Martinez-Hervas S., Mansego M. L., Gonzalez-Albert V., Ascaso J.F., Carmena R., Real J. T. and Chaves F. J. ( 2006). Semiquantitative multiplex PCR: a useful tool for large rearrangement screening and characterization. Hum Mutat. 21.

33- Letertre C., Perelle S., Dilasser F. and Fach P. (2003). A strategy based on 5' nuclease multiplex PCR to detect enterotoxin genes sea to sej of Staphylococcus aureus. Mol Cell Probes. 17:227-35

34- Ruzickova V., Voller J., Pantucek R., Petras P. and Doskar J. (2005). Multiplex PCR for detection of three exfoliative toxin serotype genes in Staphylococcus aureus. Folia Microbiol (Praha).; 50(6):499-502

35- Zschokck M., Botzler D., Blok cher S., Sommerhak J. and Hamann H. P. (2000). Detection of genes for enterotoxins (ent) and toxic shock syndrome toxin-1 (tst) in mammary isolates of Staphylococcus aureus by polymerase-chain-reaction International Dairy Journal :569-574

36- Marrack, P., and J. Kappler. (1990). The staphylococcal enterotoxins and their relatives. Science 248:705-711.

37- Bergdoll, M. S. (1979). Staphylococcal intoxications, p. 443-493. In H. Riemann and F. L. Bryan (ed.), Foodborne infections and intoxications. Academic Press, Inc., New York, N.Y.

38- Blaiotta G., Ercolini D., Pennacchia C., Fusco V., Casaburi A., Pepe O. and Villani F. (2004). PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp. strains isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seG and seI in S. aureus AB-8802. J Appl Microbiol. 97:719-30.

39- Loncarevic S., Jorgensen H. J., Lovseth A., Mathisen T. and Rorvik L. M. (2005). Diversity of Staphylococcus aureus enterotoxin types within single samples of raw milk and raw milk products. J Appl Microbiol. 98:344-50.

40- Holeckova B., Kalinacova V., Gondol J., Fotta M. and Holoda E. (2004). Production of enterotoxins by Staphylococcus aureus isolated from sheep milk. Bull. Vet. Inst. 48:41-45

41- Hu D. L., Omoe K., Shimoda Y., Nakane A. and Shinagawa K. (2003). Induction of Emetic Response to Staphylococcal Enterotoxins in the House Musk Shrew (Suncus murinus). Infect. Immun. 71:567-570

42- Hiroshi F., Satoshi M. (2006). Modeling Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in milk. Food Microbiology. 23 (5): 260–267

43- Kimura A., Igarashi H., Ushioda H., Okuzuki K., Kobayashi H. (1992). Otsuka T. Epidemiological study of Staphylococcus aureus isolated from Japanese national university and medical college hospitals. Kansenshogaku Zasshi.66:1543–1549

44- Voss A., Milatovic D., Wallrauch-Schwarz C. and Rosdahl V. T. Braveny I. (1994). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.;13:50–55



جدول شماره 1: برنامه دستگاه Termal cycler براي تکثير قطعات


تعداد سيكل‌ها

زمان

درجه حرارت

مرحله

رد[يف

1 سيكل

5 دقيقه

94 درجه

دناتوره كردن اوليه

1

30سيكل

1 دقيقه

1 دقيقه

1 دقيقه

94 درجه

55 درجه

72 درجه

دناتوره كردن

اتصال

تكثير

2

1 سيكل

5 دقيقه

72 درجه

تكثير نهايي

3







جدول شماره 2: بررسي مقاومت باكتري استافيلوكوكوس اورئوس توليد كننده انتروتوكسين تايپ Cبه 11 نوع آنتي بيوتيك مختلف

رديف

آنتي بيوتيك

حساس

نيمه حساس

مقاوم

1

لينكومايسن

+



2

تتراسيكلين

+



3

متي سيلين



+

4

وانكومايسين

+



5

آموكسي سيلين



+

6

كلوكساسيلين



+

7

كلرامفنيكل

+



8

اريترومايسين

+



9

آموكسي كلاو


+


10

آمپي سيلين


+


11

پني سيلين



+

تصوير شماره 1 : نتيجه حاصل از الكتروفورز DNA ژنوميك تخليص شده


شماره 1: : استافيلوکوکوس اورئوس داراي ژن توليد كننده انتروتوكسين تايپ A

شماره2 : ميکروکوکوس لوتئوس ATCC=9341

شماره3 : استرپتوکوکوس پيوژنز ( آزمايشگاه رفرانس)

شماره4 : باسيلوس سرئوس ATCC= 11778، NCTC=10320

شماره5 : باسيلوس پلي ميکسا ATCC= 10401 ، NCIB = 8094

شماره6: استافيلوکوکوس اورئوس داراي ژن توليد كننده انتروتوكسين تايپ C

شماره7: سالمونلا پاراتيفي NCTC=5702 A

شماره8:يرسينيا سودوتوبرکلوزيس PCTC=1070 ، RI=273

شماره 9 : اشريشيا کلي O111 ( آزمايشگاه رفرانس)

شماره10: پروتئوس ولگاريس سويه ox19 ATCC=6380

شماره 11: استافيلوکوکوس اورئوس ATCC=25923


تصوير شماره2: بررسي كيفيت پرايمرهاي ساخته شده



<!--[if !supportLists]-->1- <!--[endif]-->پرايمر F (21b) nuc 2. پرايمر (20b) nuc R 3. پرايمر (26b) secF ،4. پرايمر ,(27b) secR

<!--[if !supportLists]-->5- <!--[endif]-->پرايمر seaF (22b) 6- پرايمر seaR (25b) 7- پرايمر IpaHF (20b) كنترل مثبت

تصوير3 : نتيجه حاصل از الكتروفورز محصول واكنش PCR






1- ماركر bp100 2- قطعه تکثير يافته 397 جفت بازي ويژه شناسايي استافيلوكوكوس اورئوس و قطعه تکثير يافته 271 جفت بازي جهت شناسايي ژن انتروتوكسين تايپ C استافيلوكوكوس اورئوس 3- كنترل منفي واكنش 4- قطعه تکثير يافته 271 جفت بازي جهت شناسايي ژن انتروتوكسين تايپ C استافيلوكوكوس اورئوس 5- قطعه تکثير يافته 397 جفت بازي ويژه شناسايي استافيلوكوكوس اورئوس 6- ماركر bp100


تصوير شماره 4: تعيين اختصاصيت واكنش با استفاده از باكتري هاي مختلف


شماره 1: : نشانگر وزن مولکولي bp 100

شماره2 : ميکروکوکوس لوتئوس ATCC=9341

شماره3 : استرپتوکوکوس پيوژنز ( آزمايشگاه رفرانس)

شماره4 : باسيلوس سرئوس ATCC= 11778، NCTC=10320

شماره5 : باسيلوس پلي ميکسا ATCC= 10401 ، NCIB = 8094

شماره6: نشانگر وزن مولکولي bp100

شماره7: سالمونلا پاراتيفي NCTC=5702 A

شماره8:يرسينيا سودوتوبرکلوزيس PCTC=1070 ، RI=273

شماره 9 : اشريشيا کلي O111 ( آزمايشگاه رفرانس)

شماره10: پروتئوس ولگاريس سويه ox19 ATCC=6380

شماره 11: استافيلوکوکوس اورئوس ATCC=25923

شماره 12: استافيلوکوکوس اورئوس (داراي ژن توليد كننده انتروتوكسين تايپ C )

شماره13: استافيلوکوکوس اپيدرميديس ( آزمايشگاه رفرانس)

شماره14: استافيلوکوکوس اورئوس (داراي ژن توليد كننده انتروتوكسين تايپ C )

شماره15: استافيلوکوکوس اورئوس داراي ژن توليد كننده انتروتوكسين تايپ A

شماره 16 : نشانگر وزن مولکولي bp100


تصوير شماره 5: تعيين حساسيت بر حسب تعداد باكتري



پس از تهيه غلظت 4000 باكتري ، رقت هاي زير از باكتري براي بررسي حساسيت واكنشPCR مورد استفاده قرار گرفت

1. ماركر، 2. 4000 باكتري، 3. 2000 باكتري، 4. 1000 باكتري، 5. 500 باكتري، 6. 250 باكتري، 7. 125 باكتري، 8 .60 باكتري، 9. 30 باكتري، 10. 15 باكتري














نام کاربری :
نام رمز :
 

میکروبیولوژی (میکروب شناسی)

ایمونولوژی (ایمنی شناسی)

کنترل کیفی

هماتولوژی (خون شناسی)

بیوشیمی

بانک خون

پاتولوژی (آسیب شناسی)

مایعات بدن

ژنتیک

بیوتکنولوژی (زیست فن آوری)

نانوتکنولوژی

سم شناسی

تومور مارکر

آندرولوژی

بیولوژی سلولی و مولکولی

کلیه حقوق معنوی و مادی این سایت برای شرکت تحقیقاتی تولیدی فارمد آوران سبز محفوظ است 2017®

کونژوگه, مواد شیمیایی, اختصارات و اصطلاحات بيوشيمي , متابولیکی, ويروس‌هاي, متیلن, تومورهاي, پروستات, آنزیم فیبرینولازین, رنگ آميزي اسپور به روش دورنر, باکتریوفاژها, سنگهاي اسيد اوريكي, باكتري كلستريديوم بوتولينوم, وسترن, لنفوپروليفراتيو, انسولين, همولیتیک, لیکوئید, گليکول, لکوسیتهای, لیشمانیوز, مستندات, علی عبائیان، رئیس هیئت مدیره جامعه فن‌آوران علوم آزمایشگاهی, مولکولی, لوپ, میکروتیتر, c53c, آمونیاک, سلول‌هایتان, هموپلیمر یا هترو پلیمر, كربول, اسپکتروفتومتر, متقاضیان, ویتامین, مدیر کل آزمایشگاه مرجع, نارسایی, شیزونت انگل, بیماری عروقی, تحقيقاتي علوم پزشكي رازي, بررسي سديمان ادراري, گرانولر, سودوموناس, محیط‌های, گروه خونیA, هليكوباكترپيلوري, بیفیدیوباکتریومبر, دکتر احمد قره باغیان, پروستات, چرب, سرولوژیکی, کراسینگ, آنتی بیوتیک , آزمایشگاه مرجع سلامت, دایرکت, سرم(AST/SGOT), آنالايزر, چاقی, تخليص, ايزوآميل, Пэрсыдзкая, هیپرپاراتیروئیدی, لنفاوي, HPV, Calbiotech, Diphyllobothrium latum scolex, Landsteiner, کتاب زیست سلولی و مولکولی دکتر مجد, رفلاکس, آرتریت, ویروس هپاتیت C,